"To niełatwa technika, wciąż się jej uczymy, nie mamy jeszcze kompletu potrzebnego sprzętu" - mówi RMF FM prof. Elżbieta Pyza, kierownik Zakładu Biologii i Obrazowania Komórki Instytutu Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego. W Zakładzie pracuje już mikroskop elektronowy wyposażony w głowicę "krio", z pomocą którego można badać próbki zamrażane w pobliskim Małopolskim Centrum Biotechnologii. Metoda krio-mikroskopii elektronowej umożliwia niedostępne wcześniej badania struktury komórek i pojedynczych biomolekuł, a także procesów życiowych, w których uczestniczą. Mrożenie pozwala uchwycić i zbadać kolejne etapy tych procesów.
Grzegorz Jasiński, RMF FM: Jak wielką rewolucję w biotechnologii, w możliwości prowadzenia tego typu badań, przyniosły prace laureatów tegorocznej nagrody Nobla w dziedzinie chemii? Jak wielkim postępem jest wprowadzenie mikroskopii krio-elektronowej?
Prof. Elżbieta Pyza, kierownik Zakładu Biologii i Obrazowania Komórki UJ: To duży postęp w badaniach, głównie najmniejszych obiektów, jak również ultrastruktury komórek, czy nawet pojedynczych molekuł, jak na przykład białka. To nie było do tej pory możliwe. Mikroskopię elektronową stosowaliśmy wcześniej do preparatów utrwalonych chemicznie. To jednak prowadzi do powstania w tkankach, w komórkach różnych artefaktów. W związku z tym, to co oglądamy klasyczną metodą mikroskopii elektronowej, niekoniecznie w rzeczywistości tak wygląda. Może być przez utrwalanie chemiczne istotnie zmienione. Krio-mikroskopia daje natomiast możliwość uchwycenia danego procesu w danym momencie, ponieważ tkanki, komórki, czy pojedyncze cząsteczki, mogą zostać zamrożone i możemy je oglądać tak, jak one w danej chwili wyglądały. To mrożenie to nie jest prosta sprawa, wymaga oczywiście bardzo niskich temperatur, czasem wysokiego ciśnienia. Ale dzięki niemu możemy przyjąć, że uchwyciliśmy jakiś proces życiowy w danej chwili i w tej chwili możemy go oglądać.
Mówi pani, że to nie jest łatwe, ale czy to raczej rutyna, czy jednak jakaś sztuka? Czy można to zrobić poprawnie za każdym razem, czy udaje się tylko co któraś próbka?
Zobacz również:
To jest metoda trudna i trzeba się tego nauczyć. Nie wszyscy jeszcze sobie z tą techniką radzą. Specjalistów od tej krio-mikroskopii elektronowej - czasem nazywanej też krio-tomografią elektronową - jeśli mówimy o obserwacji trójwymiarowej, nie ma wielu. To wszystko da się zrobić, ale wymaga nauczenia się i nie jest to technika taka, że za każdym razem wszystko wychodzi. Przy czym w biologii zawsze tak jest, że wyniki są skutkiem wielu prób, uczenia się na błędach, doskonalenia się w tych technikach, aż do czasu, gdy osiągniemy efekty. Na szczęście można się wyszkolić na specjalnych kursach, w laboratoriach w Europie, które robią to rutynowo i mają sukcesy. Tam nasi pracownicy mogą się szkolić. Ta technika rozwija się już od lat, ale ze względu na potrzebny sprzęt - do zamrażania, krojenia tkanek, obserwacji - jest dość kosztowna. Nie jest więc wciąż powszechna ze względu na koszty, a po drugie brak jest specjalistów, którzy by to bardzo dobrze potrafili wykonać. Ale jak już się udaje, to rzeczywiście można precyzyjnie zobaczyć, czy wirusy, czy jakieś struktury wnętrza komórki. Tutaj schodzimy z rozdzielczością do poziomu kilku angstremów. 10 angstremów to jest 1 nanometr. Normalnie mikroskopia elektronowa to jest rozdzielczość 1-2 nm. Tutaj można zejść do kilku angstremów...
I co wtedy możemy zobaczyć?
Pojedyncze atomy. 1 angstrom to średnica atomu. Mamy więc możliwość oglądania różnych struktur na poziomie atomowym. To jest bardzo duża rozdzielczość...
Tutaj w Zakładzie Biologii i Obrazowania Komórki państwo, oprócz własnych programów badawczych, pełnicie też funkcje usługowe. Każdy, kto jest zainteresowany tego typu badaniami może się zgłosić, zapłacić i w oparciu o państwa możliwości, aparaturę, wykonać eksperyment z dowolną próbką?
Tak, oczywiście musimy najpierw zobaczyć, jakiego rodzaju jest to próbka. Przy czym jeśli chodzi o zamrażanie, jeszcze nie posiadamy całości potrzebnego sprzętu. Mam nadzieję, że w przyszłości zbudujemy zaplecze pozwalające nam zamrażać próbki różnymi metodami. Potrzebna jest wysokociśnieniowa zamrażarka, tego urządzenia nie mamy. Współpracujemy tu z Małopolskim Centrum Biotechnologii, które w sąsiednim budynku ma urządzenie, które potrafi mrozić mniejsze struktury, powiedzmy białka. Można je potem oglądać w naszym mikroskopie.
Trzeba tylko przenieść próbkę w odpowiednich warunkach przez ulicę...
Tak, w odpowiednio niskiej temperaturze ciekłego azotu, by było w stanie zamrożonym.
Jakiego typu badania państwo tu prowadzicie, swoje i zlecone?
W naszym zakładzie interesują nas najbardziej połączenia pomiędzy komórkami nerwowymi, czyli tak zwane synapsy. Chcemy zobaczyć, jak wygląda struktura tych połączeń po stronie jednej i drugiej komórki. Chcemy zobaczyć różnice między różnymi typami synaps, chcemy poznać, jak te struktury zmieniają się w rytmie dobowym. Mamy również współpracę z Małopolskim Centrum Biotechnologii, z profesorem Jonathanem Heddle'em, który buduje rodzaj takich klatek białkowych, zainteresowany jest ich strukturą. Te klatki maja dużą przyszłość, bo z ich pomocą można coś do komórek wprowadzać. Jeśli taka klatka będzie naśladowała jakieś białko, to możemy sobie wyobrazić, że do komórek, które mają być zmienione, będzie można wprowadzić jakąś substancję, czy to do zabijania tej komórki, czy innych zmian.
To taki nano koń trojański?
Tak. To coś takiego. Samo obrazowanie tych klatek różnej wielkości jest bardzo ważne, ważne jest też sprawdzenie, czy taka klatka może do komórek wejść. Mamy też bardzo ciekawy projekt, w którym zajmujemy się ultrastrukturą bakterii, w kontekście atakowania tych bakterii przez pewne bakteriobójcze peptydy. To projekt, który prowadzimy wspólnie z prof. Joanną Cichy z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii naszego Uniwersytetu. Przychodzą też do nas oczywiście wszystkie osoby, które chcą skorzystać z mikroskopii elektronowej, czy to techniką konwencjonalną, transmisyjną lub skaningową, czy z zamrażaniem. Nie mogę powiedzieć, że jesteśmy tu już w tych technikach "krio" bardzo wyspecjalizowani, jesteśmy na początku tej drogi, głównie przez to, że nie mamy jeszcze tej potrzebnej wysokociśnieniowej zamrażarki. Ona umożliwia zamrożenie tkanki, pokrojenie jej i przygotowanie do oglądania w mikroskopie elektronowym bez artefaktów wynikających z utrwalania chemicznego.
Jak długo trwa taki eksperyment?
Wszystko zależy od rodzaju eksperymentu, rodzaju tkanki. Jeśli chodzi o mikroskopię konwencjonalną, to jest technika dość powolna, w sensie przygotowania tkanek. Natomiast krio-mikroskopia jest jeszcze bardziej skomplikowana, bo cały czas musimy pamiętać o utrzymaniu tej niskiej temperatury. Jakiekolwiek niedociągnięcie sprawia, że tkanka nie wygląda tak samo. Sam proces zamrażania musi być bardzo precyzyjny, nie ma mowy o tym, by powstały kryształy lodu, bo to rozrywa tkankę. Dlatego stosuje się te bardzo niskie temperatury i szybkie zamrażanie, żeby uchwycić wszystko w danym momencie jak jest, bez żadnych uszkodzeń.
Czyli taki eksperyment to sprawa całego dnia, pół dnia, czy tygodnia?
Myślę, że raczej około tygodnia. To czas potrzebny na przygotowanie materiału, na jego pokrojenie i potem oglądanie. Czasem jest tak, że to wszystko doskonale wygląda do czasu, ale jak się spojrzy w mikroskop, to okazuje się, że eksperyment nie wyszedł. To częsty problem, że nie tak nam wyszło, jak się spodziewaliśmy. Ale to jest normalne w badaniach biologicznych, że nie ma tak, że się od razu uda. Czasem tak, ale często nie. Często trzeba to wielokrotnie powtarzać. To nie jest taka technika, którą bardzo łatwo zastosować. Jest wiele momentów, gdzie można popełnić błąd i wynik jest niezadowalający. Ale to wszystko metodą prób i błędów trzeba powtarzać i myślę, że uda nam się osiągnąć to, co zamierzamy w projektach.
(ł)
