Mikroskopy optyczne wciąż są bezkonkurencyjne przy badaniu próbek biologicznych. Problemem pozostaje jednak ich mała rozdzielczość. Udało się ją poprawić dopiero w ostatnich latach w konfokalnych mikroskopach STED. Przyrząd tego typu, jeden z pierwszych w Polsce, skonstruowała studentka Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego.
Jeszcze kilkanaście lat temu twierdzono, że z powodu ograniczenia dyfrakcyjnego mikroskopy optyczne nigdy nie będą mogły rozróżniać szczegółów mniejszych od 200 nanometrów. Ostatnio naukowcom udało się pokonać to ograniczenie i zbudować przyrządy superrozdzielcze, między innymi konfokalne mikroskopy STED. Prototypowe urządzenie tego typu powstało ostatnio na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego (FUW), w ramach pracy magisterskiej Joanny Oracz. Od przyszłego roku nowy mikroskop będzie używany nie tylko do badań z zakresu optyki, ale również do analizy próbek biologicznych.
Nauka zna wiele metod obrazowania z rozdzielczością rzędu nanometrów, w tym mikroskopię elektronową czy sił atomowych. Metody te wymagają jednak odpowiednio spreparowanych próbek i umożliwiają obrazowanie wyłącznie samej powierzchni. Gdy zamierzamy badać próbki pochodzenia biologicznego, często żywe, mikroskopia optyczna nadal jest bezkonkurencyjna. Pozwala między innymi obrazować przestrzenną strukturę próbki. Poważną wadą jest jednak mała rozdzielczość.
Za pomocą mikroskopu optycznego można rozróżniać szczegóły nie mniejsze niż połowa długości fali świetlnej oświetlającej próbkę. Ograniczenie wynika z dyfrakcji, która uniemożliwia zogniskowanie wiązki światła do punktu. Gdy użyjemy źródła światła czerwonego o długości fali na przykład 635 nanometrów, w najlepszym przypadku będziemy w stanie zobaczyć szczegóły o rozmiarach około 300 nanometrów.
W 1994 roku Stefan W. Hell z Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie w Göttingen zaproponował teoretyczny sposób przekroczenia ograniczeń dyfrakcyjnych w mikroskopii optycznej za pomocą wygaszania emisją wymuszoną (STimulated Emission Depletion, STED). Pięć lat później zbudował pierwszy superrozdzielczy mikroskop tego typu.
W standardowej fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej wiązka lasera skanuje próbkę biologiczną i lokalnie wzbudza cząsteczki barwnika, wcześniej w odpowiedni sposób wprowadzone do próbki. Po wzbudzeniu cząsteczki te zaczynają emitować światło, które po przejściu przez filtr jest rejestrowane przez detektor umieszczony za otworem konfokalnym. Rozmiar otworu powoduje, że światło z płaszczyzn poza ogniskiem obiektywu zostaje usunięte, co zwiększa kontrast obrazu. Sam barwnik dobiera się tak, aby gromadził się w interesujących badaczy fragmentach żywej komórki.
W mikroskopii STED używa się dodatkowej wiązki laserowej – wygaszającej. Wiązka ma taką długość fali, że w oświetlonych nią cząsteczkach barwnika dochodzi do emisji wymuszonej. Cząsteczki, które za pomocą emisji wymuszonej pozbyły się energii, nie są już zdolne do fluorescencji. Zatem ich światło (podobnie jak światło z emisji wymuszonej) nie przedostanie się przez filtr przed detektorem i nie będą widoczne na rejestrowanym obrazie. Istota metody STED polega na tym, że wiązka wygaszająca przypomina w przekroju obwarzanek – w środku jest wytłumiona. Jeśli tak ukształtowana wiązka zostanie odpowiednio zgrana w czasie i przestrzeni z wiązką oświetlającą, fluorescencja będzie zachodzić przede wszystkim w tym obszarze próbki, który znajduje się w centrum wiązki wygaszającej.
Dzięki drugiej wiązce obszar próbki, świecący wskutek fluorescencji, jest wyraźnie mniejszy od średnicy wiązek laserowych. Mamy taki efekt, jakbyśmy lepiej zogniskowali wiązkę oświetlającą, co oznacza, że możemy skanować próbkę z większą rozdzielczością - wyjaśnia Joanna Oracz i dodaje, że gdy rok temu rozpoczynała pracę nad swoim urządzeniem, w Polsce działał tylko jeden mikroskop typu STED, zakupiony za półtora miliona euro.
Do budowy mikroskopu konfokalnego z układem STED na Wydziale Fizyki UW wykorzystano komercyjnie dostępne elementy. Prototypowy mikroskop ma rozdzielczość około 100 nanometrów. Prace nad zwiększeniem rozdzielczości trwają. Zaletą naszego mikroskopu jest możliwość kontrolowania wszystkich parametrów i badania fizyki zachodzących zjawisk optycznych - podkreśla Joanna Oracz, obecnie doktorantka w Laboratorium Procesów Ultraszybkich Instytutu Fizyki Doświadczalnej FUW. Celem jest osiągnięcie rozdzielczości około 60 nanometrów. Pozwoliłaby ona obserwować tak drobne szczegóły, jak kolce dendrytyczne neuronów.
Podczas prac skorzystano m.in. z doświadczeń zgromadzonych przy budowie mikroskopu konfokalnego w Centrum Laserowym Instytutu Chemii Fizycznej PAN i Wydziału Fizyki UW. Barwienie próbek do testów przeprowadzał Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego.
Na podstawie informacji prasowej Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego.
